By Irwin H. Segel

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Wasser Variante1: Glyoxal-Denaturierung Es wird ein Gel von 2 bis 8 mm Dicke aus der Agarose C in eine Plattenoder R6hrchenapparatur gegossen (vgl. 20). Die RNS wird eine Stunde bei 50°C in B inkubiert. Nach dem Abkiihlen der L6sung wird sie mit 1;10 ihres Volumens an D gemischt und auf das Gel aufgetragen. 18 Stun den bei Raumtemperatur mit einer konstanten Spannung von 25 bis 30 V durchgefUhrt. Als Elektrodenpuffer dient Puffer A, der wahrend der Elektrophorese zwischen den Kammem umgepumpt werden soUte.

12) 3,0 ml A pro 10 ml verwendet werden, ausgefUllt. Nachdem auch dieses Gel polymerisiert ist, wird der Plastikfilm entfernt, die Lasung F wird ausgespiilt und die Rahrchen werden in die Apparatur eingesetzt. Die Proben werden in G gelast und mit dest. Wasser so verdiinnt, daB die Endkonzentration des Puffers die Halfte der fUr G angegebenen entspricht. Die Probenlasung wird anschlieBend mit 20000*g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Uberstand, der etwa 1 bis 2 mg Protein pro ml enthalten sollte, kann mit einem gleichen Volumen an in G eingequollenem Sephadex® G-200 superfine gemischt werden.

In Lasung D wird es fiir etwa 30 Minuten eingelegt und dann dreimal 5 Minuten mit dest. Wasser gewaschen. Die Entwicklung erfolgt in Lasung E unter visueller Kontrolle, d. h. E wird abgegossen und durch F ersetzt, wenn die Banden gut, aber noch nicht kriiftig zu sehen sind. Oberfiirbte Gele kannen nach griindlicher Wiisserung nach der ORWO-Vorschrift 700a (s. S. 49) abgeschwiicht oder ganz entfiirbt werden. Eine anschlieBende wiederholte Silberfiirbung ist maglich, allerdings erhiilt man nicht mehr das gleiche Bandenmuster wie bei der Erstfiirbung.

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